High Throughput-Aﬃnity Selection Mass Spectrometry (HT-ASMS)

・膜タンパク質AS-MS
・Target and Molecular Quest by AS-MS (TMQ)
・クライアントライブラリーを用いた結合試験サービス

HT-ASMSから見えてきた新しい低分子創薬

HT-ASMSは、従来のような生物活性を指標に化合物を探索するのではなく、標的分子との結合活性を指標にヒット化合物を探索する手法になります。従って、標的タンパク質の活性部位以外（アロステリック部位）にも結合する化合物の取得や、標的タンパク質分解における化合物探索に適用できます。また、生化学試験系の構築が困難な標的分子であるRNAやDNAにも適用可能です。HT-ASMSの手法を用いることで、これまでの戦略とは異なる新しい低分子薬の創出が可能になります。Axceleadでは、サイズ排除クロマトグラフィーと逆相クロマトグラフィーを１つに組み合わせたオンラインLC/TOF-MSシステムを構築し、HT-ASMSを実現しました。最初にサイズ排除クロマトグラフィーで化合物と標的分子の複合体を取得します。続いて逆相クロマトグラフィーにより複合体から分離した化合物を質量分析計(TOF-MS^※)で分析します(Two Dimensional Liquid Chromatography-Aﬃnity Selection Mass Spectrometry, TDLC-ASMS)。本システムを用いることで、膨大な化合物ライブラリーから標的分子に結合する化合物を迅速にスクリーニングすることができます。
^※時間依存型質量分析計(Time of Flight Mass Spectrometry, TOF-MS)

TDLC-ASMS
1. 標的分子と化合物群をインキュベート
2. サイズ排除クロマトグラフィーによる化合物複合体と非結合化合物の分離（B/F分離）
3. 逆相クロマトグラフィーによる化合物の分離
4. TOF-MSによる標的分子に結合した化合物の同定

サイズ排除クロマトグラフィー

なぜ、ラベルフリースクリーニングが選択されるのか

従来のラベルベースの方法では、アッセイ系で検出するために標的分子もしくはリガンドを蛍光標識等で修飾する必要があります。また標識することで分子の構造や機能が変化し、活性を示さないというリスクもでてきます。しかし、HT-ASMSの手法を用いれば、生化学的手法にもとづくアッセイ系を構築する過程を経ずに、ヒット化合物を同定することが可能になります。さらに、標的分子に結合した化合物をMSで直接測定することから、擬陽性等のアーティファクトが生じるリスクを抑えることができます。

スピード・効率を磨き上げ、研究現場で本当に使えるシステムを開発

どんなに画期的なシステムでもスループットが低ければ創薬研究の現場で活用することはできません。 Axceleadでは、分析に高分解能のTOF-MSを使用し、プールドライブラリーを用いたハイスループットスクリーニングを実施するシステムを構築しました。これによりAxceleadが有する製薬企業由来の高品質な大規模ライブラリー（約32-50万化合物）から、標的分子に結合する化合物を短期間で同定することが可能です。

Axceleadの大規模ライブラリーの特長

HT-ASMSを成功させるもう一つのカギは、高品質な材料を調製できるかにあります。Axceleadでは、これまで培ってきた経験をもとに、様々な材料（タンパク質、核酸等）のデザインと調製を自社で行い、ヒット化合物を創出してきました。高品質な材料は、再現性の高いHT-ASMSを実現し、真のヒット化合物の取得につながります。

HT-ASMSで切り開く新たな創薬標的への挑戦

これまで低分子の創薬標的と考えられていなかったRNA、DNAが高次構造を取っており、低分子化合物の結合によって、遺伝子発現やスプライシング等の機能を調節できることが報告されてきています。しかし、機能不明の核酸に作用する化合物を探索する生化学的アッセイ系の構築は困難です。HT-ASMSの手法を用いれば、標的RNA/DNAに直接作用する化合物を短期間に取得できます。このような手法で得られた化合物は、新しい創薬領域における大きなブレイクスルーにつながります。

事例：RNAを標的とした創薬への適用

✓FMNリボスイッチに結合する化合物をHT-ASMSの手法を用いて探索

✓Hit化合物の解離定数 K_D を算出することで、Hit化合物の標的に対する親和性を定量化

✓リガンド化合物と競合試験を実施することで、結合部位の予測や化合物間の親和性比較が可能

競争力の高い化合物を創出したい

競合他社と同じアプロ―チで化合物を探索していては、オリジナリティーの高い化合物を創出するのは困難かもしれません。しかし、結合活性という新たな指標を用いたスクリーニングなら、活性等の機能に基づく従来のスクリーニングと比べ、ユニークな化合物を取得することができます。競合他社と差別化できる化合物は、既知の標的分子であっても革新的な医薬品につながる可能性があります。

事例：結合活性を指標としたキナーゼ A に対する低分子化合物の探索

✓キナーゼ A に結合する化合物をHT-ASMSの手法を用いて探索

✓阻害作用を示す化合物だけでなく、結合活性のみを示すサイレントバインダーの取得が可能
　サイレントバインダーは、標的タンパク質分解のリガンドとして活用できる可能性が考えられます

✓サイレントバインダーもK_D値を算出することで、標的分子に対する親和性を定量化することが可能

HT-ASMSで見出されたヒット化合物について、Hit expansion、各種プロファイリングを行うことで、
化合物最適化への展開をサポートします。

進化する低分子創薬で、お客様のパイプライン創出に貢献します。
HT-ASMSを用いたヒット化合物探索は、Axceleadへご相談ください！

膜タンパク質AS-MS

－HT-ASMSで実現する膜タンパク質標的薬の創出－
（High Throughput Affinity Selection-Mass Spectrometry ）

膜タンパク質であるトランスポーターは糖尿病、高血圧症、中枢系疾患あるいは癌など、多くの疾患との関係が報告されており、重要な創薬標的として認識されています*1。しかし、これまで同定されているトランスポーターの約30％は基質が明らかになっていないオーファンのトランスポーターであることが知られおり*2、このような標的に対して評価系を構築することは、非常に難しいと考えられます。
*1: Nat. Rev. Drug Discov. 14, 543‒560, 2015
*2: Molecular Systems Biology 16: e9652, 2020

HT-ASMS は、標的と結合する低分子化合物を探索するスクリーニングの手法になります。Axcelead では、本手法を膜タンパク質にも適用できるように最適化し、結合した化合物を効率的に検出する方法を開発しました。
HT-ASMS の手法を用いれば、生化学的評価系構築が困難なオーファンの受容体やトランスポーターであっても結合する低分子化合物の探索が可能になります。

■オーファンの標的に対しても化合物探索が可能
■粗精製の膜画分でスクリーニングが可能

HT-ASMS を膜タンパク質用に最適化

－トランスポーターA の大規模スクリーニング－

膜画分を用いたHT-ASMS の事例紹介として、トランスポーターA に対して結合する化合物をスクリーニングした結果を紹介します。
Axcelead が保有するDiversity library 約10 万化合物からトランスポーターA と結合する74 化合物をヒット化合物として同定することができました。

HTS 期間: 4 ～ 5 か月

・標的のトランスポーターを発現させた膜画分を調製。
・7,900 化合物 (Pilot library) を用いてパイロットスクリーニングを実施。
・結合が見られた118 化合物 (1.5%) を選択 (Mock 画分と比較) 。

・90,782 化合物 (Diversity library) を用いてプライマリースクリーニングを実施。
・結合が見られた912 化合物 (1.0%) を選択。

・選択した候補化合物を10 化合物/Pool で再現性試験を実施。
・1030 化合物のうち137 化合物で再現性を確認 ( 再現率: 13.3%)。

・選択した137 化合物を3 化合物/Pool で濃度依存性試験を実施。
・74 化合物をヒット化合物として同定 ( ヒット率: 0.07%)。

－親和性と生物活性の相関－

選択した74 化合物について、トランポーターA に対するKd 値を算出しました。また、トランポーターA は基質が報告されていましたので、各化合物の基質の取り込み阻害も併せて検討しました。74 化合物のうち68 化合物でKd 値を得ることができました。
また、Kd 値が算出された68 化合物のうち47 化合物は取り込み阻害活性を示しました。

ヒット化合物の結合の親和性（Kd 値）と生物活性（取り込み阻害活性）は相関性を示しました。また、基質取り込み阻害活性がないサイレントバインダーも存在していました。このようにAS-MS は、生物活性では見出すことができない新たな結合ポケットや化合物を見出すことができ、これらの知見が新たな創薬への出発点になると考えられます。

Target and Molecular Quest by AS-MS (TMQ)

Axceleadの新たな結合試験サービス
ースモールスケールライブラリーで複数の標的をスクリーニングー

Target and Molecular Quest by AS-MS (TMQ) とは︖

Axcelead が保有するDiversity library から選抜したPilot library（25,000 化合物）を用いて、複数の標的あるいは複数の条件で結合試験ができるTMQ サービスの提供を開始しました。本サービスを利用することで、大規模スクリーニングを実施する前のヒット率の予測が可能となり、ターゲットの優先順位付けが可能となります。

こんなお客様に

候補となる標的が複数あることから、ターゲットの優先順位付けが難しい。
同一の標的分子で異なる複数の条件、あるいは活性型、不活性型、各ドメインでのヒット率を見極めたい。
TMQ サービスでヒットした化合物を用いて、ターゲット検証を実施したい。

ヒット探索のファーストステップに︕

同一の標的でも、活性型構造、不活性型構造のどちらに結合するかを調べることで、新たな結合様式を示す化合物が得られる可能性もあります。また、TMQ サービスでヒットした化合物を用いて、次のステップに進めるべきか、検証することも可能です。

FAQ

■TMQ サービスでは、いくつの候補分子あるいは試験条件から実施してもらえるの︖
３種以上の標的分子あるいは試験条件で実施することを想定しております。また、試験デザイン、研究立案から相談させていただくことで、お客様の要望に応じた提案ができると考えております。

■TMQ サービスの実施期間はどれくらいですか︖
スクリーニングの実施とヒット化合物の再試験で、約２から3 か月と想定しています。材料調製から弊社で受託できますので、是非お問い合わせください。

■TMQ サービスで、同じ標的に対して複数の試験条件でスクリーニングができますか︖
もちろん可能です。是非、試験デザインから相談させてください。他にも同じパスウェイ上にある複数のターゲットでスクリーニングを実施して、得られたヒット化合物で検証して標的を選定するといったことにも利用できると考えています。

■TMQ サービスでヒットした化合物の構造は開示してもらえるの︖
各標的分子あるい各条件でヒットした化合物から、上限25 化合物まで構造を開示させていただきます。また、MTA の締結と追加費用は発生しますが、在庫があれば化合物の提供も可能となっております。

■自社のライブラリー化合物で、TMQ サービスは実施してもらえるの︖
もちろん可能です。その場合、化合物の分子式を提示していただく必要があります。化合物数は上限25,000 化合物程度を想定しております。

クライアントライブラリーを用いた結合試験サービス

Axceleadの新たな結合試験サービス
ーお客様のライブラリーでバインダーのスクリーニングができます︕ー

多様なライブラリーに対応可能なAS-MS スクリーニング

Axcelead の大規模な結合試験サービスでは、化合物の精密質量をもとに、Q-TOF を用いて結合した化合物を同定しています。ライブラリー化合物の分子式の情報のみ提供していただければ、お客様のライブラリーでバインダーのスクリーニングが可能になります。弊社のライブラリー化合物と合わせてスクリーニングすることで、最適なリード化合物を見出すことが可能になります。

Client library / Hit validation

お客様のライブラリーを用いてスクリーニングを実施することで、スクリーニングの結果をより詳細に解析することが可能になります。また、DEL スクリーニング、フェノティピックスクリーニングなど、別の手法で選択したヒット化合物に対して標的分子との結合を確認することで、ヒット化合物のバリデーションにも利用できます。

ヒット化合物の構造をすべてチェック可能。
標的との結合を確認することで、ヒット化合物のバリデーションにも利用可能。

Axcelead library

Client library に加えてAxcelead library を用いてスクリーニングすることも可能です。 Diversity library に加えて、各ターゲットに最適化したFocused library を用いることで、難しいターゲットでもヒット率を上げることが期待できます。

Axcelead が保有するDiversity library 50 万化合物が使用可能。
様々なFocused library (Kinase, GPCR, PPI, RNA, Molecular glue) も使用可能。

スクリーニングの解析結果のイメージ

FAQ

■ライブラリー化合物のプレート調製はしてもらえるの︖
お客様の化合物をDMSO 溶液として提供していただければ、弊社の微量分注機（Echo）を用いてプレートを調製させていただきます。Echo での分注を想定しておりますので、384 (or 1536) プレートでの提供をお願いしています

■自社のライブラリー化合物でスクリーニングしても標的分子の調製はしてもらえるの︖
もちろん可能です。スクリーニングの鍵は、高品質な材料を調製できるかにあります。Axcelead では、これまで培ってきた経験をもとに、様々な材料（タンパク質、核酸等）のデザインと調製を自社で行い、ヒット化合物を創出してきました。高品質な材料は、再現性の高いHT-ASMS を実現し、真のヒット化合物の取得につながります。

■自社のライブラリー化合物でスクリーニングを実施するうえで、必要な情報は何ですか︖
TOF-MS で解析する上で、化合物のID と分子式が必要になります。その他の情報は提供していただく必要はありません。

■自社のライブラリー化合物でヒットした化合物でも最適化してもらえるの︖
もちろん可能です。弊社の経験豊富なケミストがヒット化合物の最適化を実施させていただきます。

■ライブラリースクリーニングではなく選抜化合物の高次評価としてAS-MS の試験を実施することはできますか︖
お客様の化合物に対してAS-MS 試験を実施することは可能です。化合物の親和性(Kd) ・乖離(T1/2)、拮抗性などの高次評価系を構築して評価いたします。さらにAS-MS による定期試験サービスも提供可能ですので、AS-MS 試験で化合物を最適化したい方は是非お問い合わせください。